小鼠心肌祖细胞的永生化及筛选

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3715-3722.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.018

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

小鼠心肌祖细胞的永生化及筛选

朱高慧¹，何通川^1，2，熊丰¹，朱岷¹，陈沅¹

¹重庆医科大学附属儿童医院干细胞研究室，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆市 400014；²美国芝加哥大学分子肿瘤研究室，伊利诺伊州，美国芝加哥 60637

修回日期:2014-05-13 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
作者简介:朱高慧，女，1980年生，重庆市人，汉族，2009年重庆医科大学毕业，博士，主治医师，讲师，于2008 年3 月至2009 年4 月应邀赴美国芝加哥大学分子肿瘤实验室学习，主要从事干细胞及骨形态发生蛋白、Wnt、维甲酸等因素对干细胞向心肌细胞分化调控的研究。获得国家发明专利1项(专利号：ZL200910191280.8)。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(30772311)；重庆市科委自然科学基金(CSTC,2010BB5107)

Immortalization and screening of cardiac progenitor cells in mice

Zhu Gao-hui¹, He Tong-chuan^{1, 2}, Xiong Feng¹, Zhu Min¹, Chen Yuan¹

¹Stem Cell Biology and Therapy Laboratory, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, and Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders, Children’s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014，China; ²Molecular Oncology Laboratory, Department of Orthopaedic Surgery, The University of Chicago Medical Center, Chicago 60637, IL, USA

Revised:2014-05-13 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
About author:Zhu Gao-hui, M.D., Attending physician, Lecturer, Stem Cell Biology and Therapy Laboratory, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, and Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders, Children’s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30772311; the Natural Science Foundation of Science Committee of Chongqing City, No. CSTC 2010BB5107

摘要/Abstract

摘要：

背景：移植外源干细胞治疗功能性心肌细胞死亡或凋亡，易导致移植并发症，因此心脏本身存在的心肌祖细胞成为理想的种子细胞。

目的：建立稳定来源于小鼠心脏的心肌祖细胞株，为研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损时的增殖分化因素提供理想的细胞模型。

方法：①分离培养胚胎15.5 d的小鼠心肌细胞。②感染反转录病毒SSR69使心肌细胞永生化，通过抗生素筛选和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌祖细胞。③筛选出具有心肌祖细胞特性的单克隆细胞株。

结果与结论：①成功分离培养出心肌细胞，部分细胞可见明显搏动。②感染病毒后，通过潮霉素筛选成功选出76个单克隆，并将其进行命名为CP15-#。③对第1-20号克隆，根据心肌细胞标志基因筛选出具有心肌祖细胞特性的克隆。表明通过可逆SV40 T抗原介导的途径成功建立永生化心肌祖细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 组织构建, 培养, 心肌祖细胞, 心肌细胞, 永生化, SSR69, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Transplantation of exogenous stem cells for functional cardiac cell death or apoptosis easily induced complications after transplantation. Therefore, cardiac progenitor cells of heart itself have been ideal seed cells.

OBJECTIVE: To establish stable cell lines of cardiac progenitor cells from mouse heart, and to provide ideal cell models for studying proliferation and differentiation factors affecting cardiac progenitor cells during adult myocardial cells were damaged.

METHODS: (1) Myocardiocytes were isolated from embryonic 15.5 days mice. (2) The cultured myocardiocytes were immortalized using retrovirus SSR69. Immortalized monoclonal myocardial cells were obtained using antibiotic selection and infinite dilution. (3) Monoclonal cell line with the property of cardiac progenitor cells was screened out.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Myocardiocytes were successfully isolated and cultured. Partial cells showed obvious beating. (2) Myocardiocytes infected with retrovirus SSR69 were cloned and got 76 clones, then were named as CP15-#, (3) Screening the first 20 clones, the reasonable clones with the characteristics of cardiac progenitor cells were obtained according to myocardial cell marker genes. The results suggested that immortalized cardiac progenitor cells were established mediated by reversible SV40 T antigen.

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Key words: myocytes, cardiac, clone cells, genes

中图分类号:

R394.2

朱高慧，何通川，熊丰，朱岷，陈沅. 小鼠心肌祖细胞的永生化及筛选[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3715-3722.

Zhu Gao-hui, He Tong-chuan, Xiong Feng, Zhu Min1, Chen Yuan. Immortalization and screening of cardiac progenitor cells in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3715-3722.

图/表（结果） 6

2.1 小鼠心肌特异性基因在心脏发育过程中的表达时序 半定量RT-PCR检测胚胎13.5 d(E13.5)、胚胎18.5 d (E18.5)，出生后1 d(D1)、3 d(D3)、7 d(D7)、14 d(D14)和8周的成年小鼠心肌细胞发育基因的表达时序。

由图2可见，胰岛因子1特异地表达在心肌细胞E13.5的早期阶段，E18.5时已经几乎检测不到；c-kit在E13.5到成体心脏的发育过程中，表达量逐渐降低，心肌谱系早期表达基因Nkx2.5随心脏的发育成熟而逐渐降低，晚期结构蛋白α-肌球蛋白重链、α-肌动蛋白和心肌蛋白T则随心脏发育成熟而逐渐增加。

2.2 永生化心肌细胞的单克隆生长 取孕15.5 d的CD1小鼠胚胎心肌细胞培养，经永生化及潮霉素筛选后，应用无限稀释法获取单克隆，接种后3 d可见单个细胞的生长，第5天时基本可见到细胞分裂形成两三个细胞，第7天时则出现了一个小的细胞克隆团，第10天时细胞克隆团基本达到1/3孔面积(图3)。

2.3 半定量RT-PCR筛选心肌祖细胞单克隆 根据图2检测心肌细胞相关基因表达时序的结果，结合文献报道^[9-13]，选取不同阶段的心肌细胞标志基因，通过RT-PCR筛选永生化的心肌祖细胞。选用基因八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4)、Nanog、Sry相关的HMG盒-2(Sox2)作为干细胞的标志基因，由图4可以看出，20个克隆中基本上都表达这些基因(图4A)。心肌祖细胞标志胰岛因子1在CP15-5A，CP15-9，CP15-10，CP15-13，CP15-18中有表达。干细胞抗原1和c-kit这两个非特异性祖细胞标志也在大多数克隆中有表达(图4B)。心肌谱系早期标志Nkx2.5、GATA结合因子4、Tbox-5、心脏神经嵴衍生表达蛋白2(Hand2)和胎肝激酶-1在CP15-5A，CP15-9， CP15-10，CP15-13，CP15-18均有不同程度的表达，其中Tbox-5表达量较高，且差异比较明显(图4C)。心肌细胞结构蛋白标志α-肌球蛋白重链、α-肌动蛋白、心肌蛋白T和心房利钠因子(ANF)表达量相对较低，且无明显差异(图4D)。将这些电泳图在BIO-RAD电泳仪上经quantity1软件分析后生成图表，转为数值比较。

2.4 免疫荧光进一步检测胰岛因子1和c-kit在胰岛因子1-Tbox-5阳性克隆中表达情况 为了进一步验证RT-PCR结果，实验应用免疫光法检测胰岛因子1和c-kit在胰岛因子1-Tbox-5阳性克隆中表达情况，结果显示同RT-PCR检测结果一致(图5)。

2.5 永生化细胞的可复性和永生化基因对细胞分化影响 AdCre感染永生化的细胞CP15-9和CP15-10后，Western Blot检测anti- SV40T表达，2组均可看出Cre可以有效去除SV40T在心肌祖细胞克隆中的表达(图6)。

永生化基因SV40T在细胞中的存在是否对细胞增殖有很大影响呢？在永生化心肌祖细胞中分别加入合适滴度的Adcre后，进行细胞计数，加入AdCre组细胞增殖相对减慢，但总体看来AdCre和AdRFP组细胞生长趋势一致，这与预期结果一致(图7)。

但是，永生化基因SV40T在细胞中的存在是否对细胞分化有很大影响呢？并且为了后续的应用简单，在细胞转染质粒MyHC-GLuc后，加入合适滴度的Adcre或AdRFP，然后用0.5 µmol/L地塞米松诱导分化，激活质粒活性，检测SV40T对分化过程的影响。

加入AdCre组细胞增殖相对减慢，因此在MyHC-GLuc活性检测时，为了结果的可比性，实验应用细胞裂解总蛋白量来标准化GLuc读数，均衡细胞量。结果可以看出，相对于空白对照组，地塞米松可以有效诱导MyHC-GLuc的活性表达(P < 0.05)，而且可以看出空白对照组或地塞米松诱导组中AdCre对MyHC-GLuc的活性影响不大(图8)。

2.6 永生化细胞株在裸鼠体内的荧光素酶成像 CP15-9和CP15-10在3次感染携带有荧光素酶反转录病毒SEB-Luc后，形成稳定表达荧光素酶的细胞株，感染AdCre或AdRFP后48 h时细胞感染率基本在60%-80%(图9A)，收集细胞移植到裸鼠皮下，移植细胞量为1×10⁶，分别在移植后第1天、3天和7天按照前述方法进行荧光素酶成像，并进行信号强度分析(图9B，图9C)。移植后随时间延长，AdCre和AdRFP组的荧光素酶信号逐渐减弱，并最终消失;且AdCre组比AdRFP组的荧光信号消失更早。这一结果证实实验建立的永生化细胞在裸鼠体内未见成瘤。

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引言

出生后心肌再生能力有限，一旦受到损伤，就不可避免的出现功能性心肌细胞死亡或凋亡，导致数量减少，影响心脏正常功能，最终导致慢性心力衰竭。传统的药物治疗和介入性治疗仅能避免心脏进一步受损，相反，干细胞治疗不仅能控制心脏进一步受到破坏，还能恢复心脏的功能^[1-3]。但是移植的外源干细胞在心肌微环境的诱导下仍然出现一系列的移植并发症^[4]，因此，需要动员心脏本身存在的心肌祖细胞来分化并代偿受损心肌功能^[5-6]。但是如何才能有效动员呢？其动员的机制是什么呢？为了解决这一系列问题，并最终实现在实验动物和临床上的归巢、分化及有效的功能替代作用，首先必须得到这些稳定的心肌祖细胞，研究其特性。

多年来，随着对心肌祖细胞研究的逐渐深入，其标志基因c-kit^+[14]、干细胞抗原1(Sca-1⁺)和胎肝激酶1(Flk-1⁺)逐步被揭示^[15-16]，但是这些标志基因都代表了心脏外不同的细胞群种，经过心脏的细胞或者停留在心脏的细胞，但很明显不是内源性的心肌干细胞(如单核细胞，巨噬细胞或血液来源细胞)^[17]。因此，有必要制定另外的标准来鉴别c-kit⁺、干细胞抗原1(Sca-1⁺)、胎肝激酶1(Flk-1⁺)中具有心肌祖细胞特性的亚型。Laugwitz等^[18]证实了一类表达LIM同源转录因子胰岛因子1祖细胞的存在，细胞谱系追踪分析证实其确实来源于心脏，在体内外均可分化为心脏的3种细胞类型(心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞)^[19-20]。但是这些存在于心脏的心肌祖细胞数量有限，在成体心脏受损(如心肌梗死)时增殖和分化能力亦有限，不能及时修复和代偿成熟心肌细胞功能，因此首先需要建立这种细胞模型，然后研究促进其快速增殖和分化的因素^[21-22]。

到目前为止的研究报道中，大多选用原代心肌祖细胞进行筛选，因为心肌细胞成分的多样性和功能的复杂性，使得这其中包含有较多的不稳定性因素，因此，为了提高研究工作的效率以及研究结果的稳定性和可重复性，实验主要目的就是以“取之于心脏，用之于心脏”为原则，应用有效的方法建立稳定的永生化的心肌祖细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2008年3月至2009年4月在美国芝加哥大学分子肿瘤实验室完成。

材料：

实验动物：选用SPF级孕15.5 d的健康CD1小鼠，美国芝加哥大学动物中心提供，喂养于严格消毒的无菌层流动物房内，环境温度维持在25 ℃，空气湿度为60%-70%，饲料和水经消毒后自由进食。

磷酸盐缓冲液(PBS)：自配0.1 mol/L NaCl 9.0 g，Na₂HPO₄.12H₂O 6.0 g，NaH₂PO₄.2H₂O 0.4 g，加少量ddH₂O磁力搅拌完全溶解后，调节pH至7.2-7.4，ddH₂O定容至1 000 mL，分装后1.05 kPa高压灭菌20 min，-4 ℃保存备用。

实验方法：

小鼠胚胎心肌细胞的分离培养：取孕15.5 d的胚胎小鼠心脏，置于100 mm细胞培养皿(含25 mL 4 ℃PBS)，切碎吹打后加入2 mL 0.25%胰蛋白酶37 ℃下消化，转移上清到10% DMEM细胞培养基中，于37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度下培养1 h，将培养基转移至新的经1%胶原包被过夜培养皿中继续培养, 24 h后换液1次，去除悬浮血细胞。

小鼠心肌细胞的永生化：经过HEK293包装后含有SSR69的反转录病毒感染心肌细胞12 h后，加入0.1 g/L的潮霉素筛选细胞，筛选时间为2周。图1为SSR69的简单示意图^[7]，其中含有永生化基因SV40T及潮霉素抗性，且在SV40前后分别加入Cre的作用靶点LoxP。

小鼠心肌细胞单克隆制备：应用无限稀释法，将筛选后的心肌细胞接种到96孔板，达到96孔板中1/3的孔中每孔只有一个细胞时停止稀释，观察细胞生长，并依次传代，观察细胞增殖能力及形态变化，最后冻存，在冻存细胞前培养基中一直加入0.1 g/L潮霉素筛选培养。

半定量RT-PCR：用Trizol试剂提取细胞总RNA，吸取10 μg总RNA通过hexamer及M-MuLV反转录酶进行反转录反应，生成cDNA，稀释5-10倍后作为PCR模板，PCR引物是通过Primer3程序设计(http://primer3.wi.mit.edu/)，大小为18-20 bp，从目标基因的3’端扩增出120-150 bp大小片段。

Western-Blot：①蛋白质的提取：在培养细胞中加入含蛋白酶及磷酸化酶抑制剂的裂解缓冲液50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；150 mmol/L 氯化钠；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠；0.1%SDS)，裂解30 min后，4 ℃离心14 000 r/min× 15 min，取上清，检测蛋白浓度并调整致相同。②十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS- PAGE)：蛋白样品加入加样缓冲液混匀，置水浴煮沸 10 min，微量注射器取蛋白样品加入加样孔底部，加压后恒压80 V电泳，待样品泳至积层胶与分离胶交界处时，改为恒压120 V，继续电泳直至溴酚蓝指示线刚好泳出，结束电泳。③蛋白质电转移：将蛋白质从SDS-PAGE凝胶上转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，转移电压25 V，转移时间为1 h。④ 封闭：用将PVDF膜放至封闭液中，室温下温和振荡1.0-2.0 h。⑤抗体孵育：用含1%脱脂奶粉的TBST按比例稀释抗体，4 ℃过夜。⑥显色：孵育完毕的PVDF膜用TBST洗3次，5 min/次;用凝胶成像仪及显影剂对目的蛋白进行检测。⑦分析：用Bio-Rad图象分析系统对所有目的条带进行分析。

分泌型荧光素酶读数：按照100 µL分泌型荧光素酶缓冲液中加入1 µL分泌型荧光素酶反应底物的比例混合配好试剂(现配现用)，然后吸取20 µL细胞培养基到1.7 mL eppendorf管，加入10 µL事先配好的反应混合物，吹吸混匀后，放入机器读数。

免疫荧光：①移除细胞培养基后PBS洗涤1次。②冰丙酮固定10 min，室温空气干燥10 min， PBS洗涤1次。③5%的与二抗同属源的血清封闭20 min，PBS洗涤1次。④Avdin-Biotin Blocking Kit封闭15 min，PBS洗涤1次，然后生物素封闭15 min。⑤孵育一抗，室温下60 min或者4 ℃过夜，PBS洗涤5 min×3次。⑥孵育结合有生物素的二抗，室温下30 min，PBS洗涤5 min×3次。⑦孵育结合有抗生物素蛋白链菌素和红色(PE)或绿色(FITC)荧光标记的三抗，室温下30 min，PBS洗涤5 min×3次。⑧抗荧光衰减的封固液封固切片。⑨荧光显微镜观察。

荧光素酶成像^[8]：使用荧光素酶成像仪，打开O₂开关和麻醉气体开关，打开麻醉箱的气压泵，放入裸鼠，待裸鼠麻醉后，腹腔注射100 μL荧光素酶底物，在确认了各个参数之后，将裸鼠放入照射区域，在腹部注射荧光素酶底物10 min后，开始取像，分析成像数据。

主要观察指标：①小鼠心脏发育过程中早期基因胰岛因子1(Islet1，ISL1)、c-kit、干细胞抗原1、GATA结合因子4、T-box 5、肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor-2C，MEF2C)、心房利钠因子(Atrialnatriuretic factor, ANF)、心脏神经嵴衍生表达蛋白2(Hand2)、Nkx2.5和晚期结构蛋白连接蛋白43、α-肌球蛋白重链、α-肌动蛋白和心肌蛋白T在心脏发育过程中的表达时间和表达量的统计学差异。②永生化心肌细胞的单克隆生长过程中的形态变化。③应用RT-PCR方法检测干细胞标志基因八聚体结合转录因子3/4(octamer- binding transcription factor 4,Oct3/4)、Nanog、Sry相关的HMG盒-2(Sry related HMG box-2，Sox2)，心肌谱系早期标志Nkx2.5、GATA结合因子4、T-box 5、心脏神经嵴衍生表达蛋白2、胎肝激酶1及心肌祖细胞表达基因胰岛因子1、干细胞抗原-1、c-kit表达情况综合筛选出心肌祖细胞。④永生化细胞中永生化基因猿肾病毒40大T抗原基因(simian virus 40 large tumor antigen；SV40T)对细胞分化和细胞生长的影响。⑤通过荧光素酶检测永生化细胞在裸鼠体内是否成瘤。

统计学分析：用微软Excel计算标准差，使用双尾Student t 检验统计样本之间的统计差异性。P ≤ 0.05定义为差异有显著性意义。

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讨论

本实验沿用Cai等建立肝脏细胞株的原理^[7]，先将含SV40Tag(猿肾病毒40大T抗原基因，simian virus 40 large tumor antigen)单纯麻疹病毒胸昔激酶和潮霉素抗性基因侧面连接LoxP位点的重组SSR69反转录病毒转染永生化基因导入体外培养的心肌原代细胞，通过抗生素筛选，获得永生化心肌细胞，使其获得体外增殖能力，然后再用含有基因编码Cre重组酶的重组腺病毒(AdCre)，在特殊位点重组而将SV40Tag切除，使细胞株恢复到永生化前的状态，这一点在本课题中通过Western-Blot得到了证实。同时，也比较了SV40T的存在对细胞增殖的影响，SV40敲除后细胞增殖速度减慢，但是生长趋势无明显区别。将敲除或未敲除SV40T的心肌祖细胞克隆CP15-9和CP15-10移植到免疫缺陷型的裸鼠皮下，移植的4组祖细胞并未形成肿瘤，因此也从另一方面证实了SV40T对心肌祖细胞的诱导分化影响不大，同时又为心肌祖细胞株的应用提供了安全保障。

在筛选鉴定心肌祖细胞的过程中，由于各家报道的心肌祖细胞分离与鉴定的方法与标记物的不同，因此实验首先检测从胚胎13.5 d到成年大鼠的心脏发育过程中基因的表达时序，结合文献报道，作者选用特异性较高的祖细胞标志基因胰岛因子1结合心肌细胞谱系的标志基因Nkx2.5和Tbox-5作为的筛选心肌祖细胞的主要指标，干细胞标志八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4)、Nanog、Sry相关的HMG盒-2(Sox2)用来检测实验所分离的细胞是否具有干细胞自我更新的标志基因，心肌祖细胞标志和心肌细胞谱系标志来衡量细胞所处的心肌细胞发育的阶段。研究结果表明通过可逆SV40 T抗原介导的途径成功建立永生化心肌祖细胞，为研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损时的增殖分化因素提供理想的细胞模型。

虽然目前的研究证实条件永生化的心肌祖细胞不仅可以保持细胞长期增殖，而且保留了心肌细胞分化潜能，但是仍需进一步研究这些永生化的心肌祖细胞在心肌梗死模型小鼠体内的作用。由于心肌细胞的分化过程是一个非常复杂、相互协调和异构的过程，永生化的心肌祖细胞能否在体内形成典型的初级心肌(早期增殖的心肌细胞，心脏起搏器样细胞，His系统，浦肯野细胞样细胞)和工作心肌(心房和心室)将是一个很具挑战但也很有意义的研究方向。

小鼠心肌祖细胞的永生化及筛选

Immortalization and screening of cardiac progenitor cells in mice

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